Search :
Project
Project Title :
การใช้ gus ยีน เพื่อศึกษาพฤติกรรมของไรโซเบียมในระบบนิเวศ (Using Gus Gene for Study Rhizobial Behavior in Ecosystem)
downloaded 49 times
Researcher Name :
หนึ่ง เตียอำรุง (Neung Teaumroong)
Abstract :
บทคัดย่อ ได้ทำการคัดเลือกชนิดของยีนที่จะนำมาใช้โคลนเข้าสู่แบคทีเรียกลุ่มไรโซเบียม ได้แก่ ยีนคลอเรสเตอรอลออกซิเดส (Chloresterol oxidase) ยีนโปรตีนสีเขียวเรืองแสง (GFP : Green Flvorescent Protein gene) และยีนบีต้ากูลคูโรนิเดส (-glucuronidase, gus gene) ในการเลือกใช้ยีนคลอเรสเตอรอลออกซิเดสที่ทำการโคลนเข้าสู่พลาสมิด PCKMI โดยเลือก consitutive promotor จาก megaplasmid ของ Mesorhizobium huakii bv. Renge สายพันธุ์ B3 จนได้พลาสมิดลูกผสมใหม่ที่ชื่อ pCBBR1 จากนั้นทำการโคลนเข้าสู่ E. coli DH พบว่ามีการแสดงออกของเอนไซม์ที่สมบูรณ์แต่คาดว่าไม่น่าจะเหมาะสม เมื่อนำไปใช้กับไรโซเบียมเพราะลักษณะสีของการแสดงออกที่ปรากฎมีสีแดงเหมือนสีของ leghaemoglobin ในปมที่สมบูรณ์ของถั่วซึ่งทำให้ยากต่อการจำแนกว่าสายพันธุ์มดเป็นสายพันธุ์ท้องถิ่นหรือสายพันธุ์ที่ใส่ลงไป ส่วนยีนชุดที่สองคือ gfp gene ได้ทำการเชื่อมชุดยีนลงไปในพลาสมิด pBBR 122 ที่มี Ptac promotor จนได้พลาสมิดลูกผสม pBBR-TGFPuv จากนั้นทำการโคลนเข้าสู่ Bradyrhizobium sp. สายพันธุ์ B34 ด้วยวิธี electroporation ผลการแสดงออกสามารถตรวจสอบได้ภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต ทำให้เห็นโคโลนีเป็นสีเขียวเรืองแสง ซึ่งสามารถตรวจสอบพฤติกรรมการอยู่รอดได้ ในส่วนของ gus gene นั้นได้ใช้กับ Bradyrhizobium sp สายพันธุ์ TAL 1000 จากถั่วลิสง (Arachis hypogaea) และ B japonicum TAL 379 ซึ่งแยกได้จากถั่วเหลือง (Glycine max) โดยเชื้อ Bradyrhizobium sp. ที่เป็น conjugants แล้วจะนำมาทำเป็นหัวเชื้อเพื่อคลุกกับเมล็ดถั่วที่เหมาะสมในแต่ละพืชอาศัย โดยหลังจากปลูกไปแล้ว 30 วัน จะเก็บรากถั่วมาย้อมด้วย x-gluc ในการทดสอบการเข้าไปอาศัยอยู่ในปมรากถั่วของ Bradyrhizobium sp. ครั้งนี้จะทดสอบโดยตัวอย่างดินหลายชนิด เปอร์เซนต์ของจำนวนไรโซเบียมที่สามารถเข้าไปอาศัยอยู่ในปมรากถั่ววิเคราะห์จากจำนวนเนื้อเยื่อของปมที่ปรากฎเป็นสีฟ้าจากการย้อมด้วย x-gluc ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าดินที่เก็บจากบริเวณที่ปลูกต้นยูคาลิปตัสพบว่ามีการแก่งแย่งกับไรโซเบียมที่ใส่ลงไปน้อยที่สุดในขณะที่ดินบริเวณที่ปลูกต้นสักมีการแข่งขันสูงสุดในการเข้าไปสร้างปมมากกว่าดินจากบริเวณอื่นๆ ซึ่งดูเหมือนจะมีความสัมพันธ์กับปริมาณอินทรีย์ที่มีน้อยในดินชุดนี้ Abstract To monitor the rhizobial behavior, three reporter genes as chloesterol oxidase (choA), green fluorescent protein (gfp)and (-glucuronidase, (gus) were selected. ChoA gene was cloned into PCKMI habouring consitutive promotor which was derived from megaplasmid of Mesorhizobium huakii bv. Renge strain B3. The hybrid plasmid was named as pCBBR1 then transformed into E. coli DH. The complete expression was achieved. However, red-developing colour form transformant was not appropriate to apply with rhizobium since presence the same colour leghaemoglobin in plant nodule. For using gfp gene, it was pBBR-TGFPuv. Plasmid was transformed in Bradyrhizobium sp. B64 by electroporation technique. The expression of transformant was detected under UV-illiminator which gave the bright green colony. To investigate the behavior of Bradyrhizobia inocula in the field, Bradyrhizobium sp TAL 1000 isolated from Arachis hypogaea and B japonicum TAL 379 from Glycine max were choosen in this.
Publications :
No
View Publications
Detail
Award/Honor :
Name
Sponsor
Get Date
IRD SEARCH
|
IRD LOGIN