Search :

Project Project Title : การพัฒนา mantainer line ของทานตะวัน โดยวิธีการรวมโปรโตพลาสต์ (Development of sunflower (Helianthus annuus L.) maintainer lines via protoplast fusion)     downloaded 117 times Researcher Name : ปิยะดา อลิฌาณ์ ตันตสวัสดิ์ (Piyada Tantasawat) Abstract : บทคัดย่อ การวิจัยเพื่อพัฒนาทานตะวัน (Helianthus annuus L.) สายพันธุ์บีโดยวิธีรวมโปรโต-พลาสต์สำหรับใช้ในการผลิตพันธุ์ลูกผสมแบ่งออกเป็น 4 ส่วน ดังต่อไปนี้ (1) การตรวจสอบสายพันธุ์ทานตะวันที่มีไซโตพลาสซึมแบบปกติ (normal cytoplasm) ที่ระดับดีเอ็นเอ ใช้วิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (polymerase chain reaction; PCR) โดยใช้ไพรเมอร์ 3 ชนิด คือ atpAF, orfH522R และ orfH873R เพิ่มปริมาณยีนตรวจสอบในไซโตพลาสซึม atpA และบริเวณใกล้เคียง ทดสอบทานตะวันจาก North Central Regional Plant Introduction Station 10 สายพันธุ์ และสายพันธุ์ที่มีไซโต- พลาสซึมเป็นหมัน 10A พบว่า สายพันธุ์ PI 420138, PI 480472 และ 10A มีไซโตพลาสซึมเป็นหมัน ในขณะที่สายพันธุ์ Ames 3225, PI 221693, PI 307831, PI 318468, PI 377528, PI 431511, PI 441983 และ PI 500689 มีไซโตพลาสซึมปกติ และได้คัดเลือกสายพันธุ์ PI 441983 และ 10A สำหรับใช้ในการทดลองแยก เพาะเลี้ยง และรวมโปรโตพลาสต์ (2) การแยกโปรโตพลาสต์ (protoplast isolation) จากเนื้อเยื่อลำต้นอ่อนและใบทานตะวัน ทำการแยกโปรโตพลาสต์จากเนื้อเยื่อลำต้นอ่อนและใบทานตะวันสายพันธุ์ 10A และ PI 441983 โดยใช้วิธีการแยกโปรโตพลาสต์ และระดับความเข้มข้นเอนไซม์ cellulase ที่แตกต่างกัน แสดงให้เห็นว่า การแยกโปรโตพลาสต์จากเนื้อเยื่อลำ-ต้นอ่อนด้วยวิธีการซึ่งประกอบด้วย 1% (w/v) macerozyme และ 1% (w/v) BSA ในสารละลายแยกโปรโตพลาสต์ (336 mM KCl, 16 mM CaCl2 และ 3 mM MES, pH 5.7) บ่มย่อยผนังเซลล์ที่อุณหภูมิ 25°ซ เป็นเวลา 4 ชม. ร่วมกับ cellulase 1% (w/v) เหมาะสมสำหรับทานตะวันสายพันธุ์ PI 441983 เนื่องจากมีแนวโน้มให้จำนวนโปรโตพลาสต์มีชีวิตสูงสุด คือ 1.96 × 106 โปรโตพลาสต์/เนื้อเยื่อ 1 ก. ในขณะที่สายพันธุ์ 10A ให้จำนวนโปรโตพลาสต์สูงสุดถึง 4.24 × 106 โปรโตพลาสต์/เนื้อเยื่อ 1 ก. เมื่อใช้วิธีการซึ่งประกอบด้วย 0.5% (w/v) macerozyme ในสารละลายแยกโปรโต-พลาสต์ (308 mM NaCl, 5.37 mM KCl, 41.7 mM CaCl2.2H2O และ 3.3 mM MES, pH 5.6) บ่มย่อยผนังเซลล์ที่อุณหภูมิ 25°ซ เป็นเวลา 16 ชม. ร่วมกับ 1% (w/v) cellulase สำหรับการแยก โปรโตพลาสต์จากเนื้อเยื่อใบ พบว่า การใช้ cellulase ที่ความเข้มข้น 0.1 และ 0.5% (w/v) ร่วมกับวิธีการที่ประกอบด้วย 0.05% (w/v) driselase, 0.02% (w/v) macerozyme และ 0.1% (w/v) BSA ในสารละลายแยกโปรโตพลาสต์ (336 mM KCl, 13.6 mM CaCl2 และ 3.59 mM MES, pH 5.7) บ่มย่อยผนังเซลล์ที่อุณหภูมิ 25°ซ เป็นเวลา 16 ชม. เหมาะสมสำหรับสายพันธุ์ 10A และ PI 441983 ตามลำดับ โดยให้จำนวนโปรโตพลาสต์สูงสุด 6.13 และ 8.81 × 106 โปรโตพลาสต์/เนื้อเยื่อ 1 ก. ตามลำดับ วิธีการแยกโปรโตพลาสต์ที่ให้จำนวนโปรโตพลาสต์มีชีวิตสูงสุดสำหรับเนื้อเยื่อลำต้นอ่อนสายพันธุ์ 10A และเนื้อเยื่อใบสายพันธุ์ PI 441983 จะนำไปใช้ในการผลิตโปรโต-พลาสต์สำหรับการทดลองเพาะเลี้ยงและรวมโปรโตพลาสต์ (3) การเพาะเลี้ยงโปรโตพลาสต์ (protoplast culture) จากเนื้อเยื่อลำต้นอ่อนและใบทานตะวัน เพาะเลี้ยงโปรโตพลาสต์ลำต้นอ่อนจากสายพันธุ์ 10A และโปรโตพลาสต์ใบจากสายพันธุ์ PI 441983 ด้วยวิธีการเพาะเลี้ยง L4 regeneration และ mKM regeneration ที่ความหนาแน่นโปรโตพลาสต์ 5 × 103 และ 5 × 104 โปรโตพลาสต์/มล. พบว่า มีเพียงโปรโตพลาสต์ลำต้นอ่อนของสายพันธุ์ 10A เท่านั้นที่เจริญและพัฒนาในอาหารเพาะเลี้ยง โดยการเพาะเลี้ยงด้วยวิธีการ L4 regeneration ที่ความหนาแน่นโปรโตพลาสต์ 5 × 104 โปรโตพลาสต์/มล. มีการแบ่งเซลล์ และเกิดโคโลนีสูงสุด คือ 44.46 และ 18.15 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ในขณะที่ไม่พบการแบ่งเซลล์และการเกิดโคโลนีเมื่อเพาะเลี้ยงด้วยวิธีการ mKM regeneration (4) การชักนำให้เกิดการรวมโปรโตพลาสต์ (protoplast fusion) โดยการใช้สารเคมี polyethylene glycol (PEG) ชักนำให้เกิดการรวมโปรโตพลาสต์ระหว่างโปรโตพลาสต์ ลำต้นอ่อนจากสายพันธุ์ 10A และโปรโตพลาสต์ใบจากสายพันธุ์ PI 441983 โดยใช้ระดับความเข้มข้น PEG 8000 (0, 10, 20 และ 30 เปอร์เซ็นต์) และระยะเวลาชักนำการรวมโปรโตพลาสต์ (10, 15 และ 20 นาที) ที่แตกต่างกัน พบว่า การชักนำการรวมโปรโตพลาสต์ด้วย 20% (w/v) PEG 8000 ในสารละลายรวมโปรโตพลาสต์ (5% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO), 90 mM mannitol, 60 mM CaCl2 และ 25 mM glycine, pH 5.6-5.7) เป็นเวลา 15 นาที เหมาะสมสำหรับใช้ในการชักนำให้เกิดการรวมโปรโตพลาสต์ เนื่องจากทำให้เกิด binary fusion สูง (26.16 เปอร์เซ็นต์) และเกิด multi fusion ต่ำ (12.96 เปอร์เซ็นต์) อย่างไรก็ตาม จากผลการวิจัยที่ได้ ยังไม่สามารถชักนำโปรโต- พลาสต์ให้พัฒนาเป็นต้นพืชที่สมบูรณ์ได้ ซึ่งเป็นขั้นตอนที่สำคัญและจำเป็นต้องศึกษาเพิ่มเติมเพื่อให้สามารถนำไปใช้พัฒนาต้นลูกผสมจากการรวมโปรโตพลาสต์ต่อไป Abstract The followings were the research conducted to generate B-line of sunflower (Helianthus annuus L.) by protoplast fusion for hybrid production. (i) Examination of normal cytoplasms of sunflower at the DNA level. Polymerase chain reaction (PCR) method with three primers (atpAF, orfH522R and orfH873R) was used to evaluate cytoplasmic genetics at atpA and near atpA gene of 10 sunflower lines from North Central Regional Plant Introduction Station and a male-sterile line, 10A. It was found that PI 420138, PI 480472 and 10A lines were cytoplasmic male sterile (CMS) while Ames 3225, PI 221693, PI 307831, PI 318468, PI 377528, PI 431511, PI 441983 and PI 500689 lines possessed normal cytoplasm. PI 441983 and 10A were selected for protoplast isolation, culture and fusion. (ii) Isolation of sunflower protoplasts from hypocotyl and young leaf tissues. Isolation of hypocotyl and young leaf protoplasts from 10A and PI 441983 lines using various isolation methods and cellulase concentrations showed that when hypocotyl tissue was used, the combination of isolation method that used 1% (w/v) macerozyme and 1% (w/v) BSA in isolation solution (336 mM KCl, 16 mM CaCl2 and 3 mM MES, pH 5.7) incubated at 25°C for 4 hours with 1% (w/v) cellulase was the most suitable isolation procedure for PI 441983 line because it tended to give the highest number of viable protoplasts (1.96 × 106 protoplasts/g fresh weight). By contrast, 10A line gave the highest number of viable protoplasts (4.24 × 106 protoplasts/g fresh weight) when 0.5% (w/v) macerozyme in isolation solution (308 mM NaCl, 5.37 mM KCl, 41.7 mM CaCl2.2H2O and 3.3 mM MES, pH 5.6) incubated at 25°C for 16 hours with 1% (w/v) cellulase was applied. For young leaf tissue, using cellulase concentrations of 0.1 and 0.5% (w/v) in combination with isolation method that used 0.05% (w/v) driselase, 0.02% (w/v) macerozyme and 0.1% (w/v) BSA in isolation solution (336 mM KCl, 13.6 mM CaCl2 and 3.59 mM MES, pH 5.7) incubated at 25°C for 16 hours were the most appropriate for 10A and PI 441983 lines, respectively, resulting in the highest numbers of viable protoplasts (6.13 and 8.81 × 106 protoplasts/g fresh weight, respectively). The isolation procedure that gave the highest numbers of viable protoplasts for hypocotyl tissue of 10A and young leaf tissue of PI 441983 were used for protoplast culture and fusion. (iii) Culture of hypocotyl and young leaf protoplasts of sunflower. Hypocotyl protoplasts of 10A line and young leaf protoplasts of PI 441983 line were cultured using different culture protocols, L4 regeneration and mKM regeneration, and protoplast densities, 5 × 103 and 5 × 104 protoplasts/ml. It was found that only hypocotyl protoplasts from 10A developed in culture medium. Culturing protoplasts using L4 regeneration protocol with 5 × 104 protoplasts/ml density resulted in the highest values of cell division and colony formation (44.46 and 18.15%, respectively), whereas no cell division and colony formation was observed when using mKM regeneration protocol. (iv) Induction of protoplast fusion by a chemical, polyethylene glycol (PEG). Protoplast fusion between hypocotyl protoplasts of 10A line and young leaf protoplasts of PI 441983 was induced using different concentrations of PEG 8000 (0, 10, 20 and 30% (w/v)) and induction periods (10, 15 and 20 min). It was found that 20% (w/v) PEG 8000 in fusion solution (5% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO), 90 mM mannitol, 60 mM CaCl2 and 25 mM glycine, pH 5.6-5.7) with 15 min of induction period was the most proper combination for induction of fusion because of high percentage of binary fusion and low percentage of multi fusion (26.16 and 12.96%, respectively). However, regeneration from protoplasts into complete plants which is a crucial step was still unsuccessful, necessitating additional work to be able to fully exploit the protoplast fusion for developing useful cybrids in the future. Publications : No  View Publications  Detail Award/Honor :  Name  Sponsor  Get Date

IRD SEARCH | IRD LOGIN