Search :

Project Project Title : การประยุกต์ใช้ระบบอิเลคโตรดิอิออนไนซ์เซชั่นในการแยกโปรตีนเอ็นเทอโรไคเนสจากน้ำหมัก (Separation of enterokinase from fermentation broth using electrodeionization)     downloaded 25 times Researcher Name : อภิชาติ บุญทาวัน (Apichat Boontawan) Abstract : ในปัจจุบัน เอ็นเทอโรไคเนสได้กลายเป็นเครื่องมือที่สำคัญสำหรับการตัดฟิวชั่นรีคอมบิแนนท์โปรตีนในหลอดทดลองเนื่องจากมีความจำเพาะเจาะจงสูงต่อตำแหน่งตัดจำเพาะ ((Asp)4–Lys) และ มีความคงทนต่อสภาวะในการทำปฏิกิริยาที่หลากหลาย ในการทดลองนี้ ได้ทำการผลิตเอ็นไซม์รีคอมบิแนนท์เอ็นเทอร์โรไคเนสสายสั้น (rEKL) โดยเชื้อ Pichia pastoris Y11430 จากการทดลองกระบวนการหมักแบบกึ่งกะอย่างง่าย พบว่าสามารถประสบความสำเร็จในการเลี้ยงเซลล์ให้ได้ความเข้มข้นสูง โดยมีการควบคุมอัตราการเจริญจำเพาะคงที่ ที่แตกต่างกันดังนี้คือ 0.006, 0.0075, และ 0.0105 ต่อชั่วโมง ซึ่งค่าเหล่านี้ได้ถูกเลือกนำมาใช้การให้อาหารที่มีเมทานอลเป็นส่วนประกอบ (อาหาร MF) แบบเอ็กโปเนนเชียลในช่วงของการผลิตด้วยเมทานอล ที่อัตราการเจริญจำเพาะคงที่ 0.0075 ต่อชั่วโมง พบว่าความหนาแน่นของเซลล์สูงสุด 128 กรัมต่อลิตร ความเข้มข้นโดยรวมของโปรตีน343.19 มิลลิกรัมต่อลิตร และ กิจกรรมของเอ็นไซม์อยู่ที่ 38,125 หน่วยต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ เมื่อทำการเปรียบเทียบกับค่าอัตราการเจริญจำเพาะคงที่ 0.0105 ต่อชั่วโมง พบว่าเกิดการยับยั้งอย่างรุนแรงต่อการเจริญของเซลล์และมีการผลิตผลิตภัณฑ์ที่ต่ำ เนื่องจากการใช้อัตราการป้อนเมทานอลที่สูงเกิดไป สำหรับการป้อนที่อัตราการเจริญจำเพาะคงที่ 0.006 ต่อชั่วโมง พบว่าความเข้มข้นของเซลล์มีค่าต่ำสุด เนื่องจากอัตราการป้อนที่ต่ำที่สุดนั่นเอง ถึงแม้ว่าอัตราการเจริญจำเพาะคงที่ที่ 0.006 ต่อชั่วโมง จะไม่ทำให้การสะสมของรีคอมบิแนนท์เอ็นเทอร์โรไคเนส สูงสุด แต่ทำให้การแสดงออกจำเพาะของเอ็นไซม์มีค่าสูงสุดที่ 389,326 หน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีน เมื่อเปรียบเทียบกับ 122,975 หน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีน ที่อัตราการเจริญจำเพาะคงที่ 0.0075 ต่อชั่วโมง หลังจากผ่านชั่วโมงที่ 117 ของเวลาชักนำให้เกิดการแสดงออกของเอ็นไซม์ นอกจากนี้ การเพิ่มขึ้นของเวลาชักนำจนถึงชั่วโมงที่ 117 สำหรับค่าอัตราการเจริญจำเพาะคงที่ของทั้ง 0.006 และ 0.0075 ต่อชั่วโมง ส่งผลให้มีการเพิ่มขึ้นของความหนาแน่นของเซลล์ ความเข้มข้นโดยรวมของโปรตีน การสะสมของเอ็นไซม์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งการแสดงออกจำเพาะของเอ็นไซม์ รีคอมบิแนนท์เอ็นเทอร์โรไคเนสสายสั้น ซึ่งเป็นค่าที่สูงกว่ารายงานการวิจัยก่อนหน้า เป็นอย่างมาก ได้มีการทำบริสุทธิ์เอ็นไซม์รีคอมบิแนนท์เอ็นเทอร์โรไคเนสสายสั้น โดยใช้เทคนิคอิเลคโตรดิไอออไนเซชั่น (EDI) แต่จากผลการทดลองไม่สามารถแยกเอ็นไซม์ดังกล่าวออกจากน้ำหมักได้ จึงนำตัวอย่างผ่านโครมาโตกร๊าฟฟี่แบบแลกเปลี่ยนประจุลบ (SP-FF คอลัมน์) ซึ่งผลการทดลองพบว่า ได้ปริมาณของเอ็นไซม์รีคอมบิแนนท์เอ็นเทอร์โรไคเนสสายสั้นบริสุทธิ์จำนวน 3,542 ไมโครกรัม จากของเหลวใส 330 มิลลิลิตรที่ได้จากอัตราการเจริญจำเพาะที่ 0.0075 ต่อชั่วโมง นอกจากนี้ รีคอมบิแนนท์ฟิวชันโปรตีน Os1BGlu4-Trx จากข้าวได้ถูกตัดจนเกือบสมบูรณ์โดยใช้เอ็นไซม์ที่ผ่านการทำบริสุทธิ์นี้ Abstract Recently, enterokinase has become a useful tool for an in vitro digestion of recombinant fusion protein because of its high specificity for the recognition sequences (Asp)4–Lys, and its tolerance to a wide range of reaction conditions. In this work, a high activity recombinant enterokinase light chain (rEK¬L) was produced by Pichia pastoris Y11430. With a simple fed-batch technique, high cell density cultivation was successfully achieved. Different constant specific growth rates (µset) at 0.006, 0.0075, and 0.0105 hr-1 were chosen to pre-determine the exponential feeding strategy of methanol feed medium (MF medium) during the methanol production phase. At µset of 0.0075 hr-1, the highest cell density, total protein concentration and accumulation of the rEKL were obtained at approximately 128 g. L-1, 343.19 mg. L-1, and 38125 U. mL-1; respectively. In comparison, the µset of 0.0105 hr-1 resulted in severe inhibition of cell growth and low product formation due to excessive feeding rate. The feeding rate at µset 0.006 hr-1 resulted in the lowest cell concentration clearly due to the lowest feeding rate. The µset of 0.006 hr-1 did not result in the highest rEKL accumulation; however, the highest specific activity reached the maximum value of 389,326 U.mg-1proteins, compared to 122,975 U. mg-1proteins at the µset of 0.0075 hr-1 after 117hr of the induction time. In addition, an increase of the induction time to 117hr for both µset 0.006 and 0.0075 hr-1 resulted in the higher cell density, total protein concentration, rEKL accumulation, and specially specific activity of rEKL which was much higher than all previously reported articles. Purification of the recombinant EKL was initially performed using electrodionization technique (EDI); however, this technique could not separate the protein from fermentation broth. The protein was further purified by the cation exchange chromatography (SP_FF column). Experimental result showed that 1540 mg.L-1 of rEKL was obtained from 6475.33 mg.L-1 of total protein. The recombinant fusion protein, rice Os1BGlu-Trx was almost completely cleaved by using this purified rEKL. Publications : No  View Publications  Detail Award/Honor :  Name  Sponsor  Get Date

IRD SEARCH | IRD LOGIN