Search :
Project
Project Title :
การศึกษาคุณลักษณะและการแสดงออกของเอนไซม์กลุ่มไกลโคซิลไฮโดรเลสจากพืชไทย (Expression and characterization of Thai Plant glycosyl hydrolases)
downloaded 123 times
Researcher Name :
James R.Ketudat-Cairns
Abstract :
บทคัดย่อ การผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีนเป็นขั้นตอนหนึ่งที่สำคัญในการศึกษาหน้าที่ของยีน แต่เป็นการยากที่จะผลิตโปรตีนของพืชหรือยูคาริโอตให้อยู่ในรูปที่ทำงานได้โดยใช้ระบบรีคอมบิแนนท์หรือแม้แต่การแยกโปรตีนออกมาจากสิ่งมีชีวิตกลุ่มนี้โดยตรง ในโครงการนี้เราได้พยายามสร้างระบบการผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีนของ -glucosidases จากพะยูงและฉนวน (Dalbergia sp.) และการแยกโปรตีนออกมาให้บริสุทธิ์ ศึกษาการทำงานของเอนไซม์ พัฒนาการตัดต่อยีนและการผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีนของเอนไซม์พืช ในระบบต่างๆ ให้สะดวกและรวดเร็ว จากการทดลองในช่วงแรกที่ได้พยายามผลิต -glucosidases ของ Dalbergia ใน Pichia pastoris โดยให้มี polyhistidine tags ต่ออยู่ที่ปลายคาร์บอกซี่และปลายอะมิโนของโปรตีน และให้มีการส่งโปรตีนที่ผลิตได้ออกนอกเซลล์ยีสต์ พบว่าตรงส่วนปลายของโปรตีนที่มี polyhistidine tags ต่ออยู่ถูกย่อยออกไป จึงได้แก้ปัญหานี้ด้วยการตัดกรดอะมิโนตรงปลายคาร์บอกซี่และปลายอะมิโนของโปรตีนออกไป และพบว่าการตัดกรดอะมิโนจำนวน 12 ตัวทางด้านปลายอะมิโนของเอนไซม์ dalcochinase ของ D. cochinchinensis ออกสามารถแก้ปัญหานี้ได้ จึงทำให้แยกโปรตีนออกมาให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี immobilized metal affinity chromatography (IMAC) ได้ โปรตีนที่ผลิตและแยกออกมาให้บริสุทธิ์ได้ด้วยวิธีนี้มีสมบัติต่างๆ คล้ายกับ dalcochinase ที่แยกได้จากเมล็ด ก่อนหน้านี้เราได้ผลิตโปรตีนจาก cDNA ของ D. nigrescens ใน E. coli และ P. pastoris แต่โปรตีนที่ได้อยู่ในสภาพที่ไม่ทำงาน ดังนั้นจึงได้นำ cDNA ของ D. nigrescens ไอโซไซม์ที่ 2 ซึ่งให้ชื่อว่า dnbglu2 มาผลิตโปรตีนและพบว่าโปรตีนที่ได้อยู่ในรูปที่ทำงานได้ แต่ไม่สามารถแยกโปรตีนออกมาให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี IMAC การตัดกรดอะมิโนทางด้านปลายอะมิโนของโปรตีนนี้ออกด้วยวิธีการเดียวกับที่ใช้กับ dalcochinase ทำให้แยกโปรตีน Dnbglu2 ออกมาให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี IMAC ได้ โปรตีนนี้มีการทำงานแตกต่างจากเอนไซม์ที่แยกได้จากเมล็ด D. nigrescens เพียงเล็กน้อย เอนไซม์ของ D. nigrescens ที่ผลิตได้สามารถย่อย isoflavone 7-O--glycosides ได้ดีกว่า dalcochinase ของ D. cochinchinensis แต่ย่อย dalcochinin -glucoside ซึ่งเป็นสับสเตรทของ dalcochinase ได้ต่ำกว่า dalcochinase เพื่อที่จะเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตเอนไซม์ไกลโคซิเดสของพืชให้ดีและเร็วยิ่งขึ้นเราจึงได้พัฒนา Gateway cloning and expression system โดยการเปลี่ยนดีเอ็นเอพาหะ (expression vector) ที่ใช้ได้ผลดีในระบบการผลิตโปรตีนใน E. coli และ P. pastoris ได้แก่ pET32 และ pPICZBNH8 ตามลำดับ ไปเป็น Gateway destination vectors และยังได้นำวิธีนี้ไปใช้กับดีเอ็นเอพาหะชนิดอื่นๆ ด้วย ได้ทดสอบระบบนี้กับ -glucosidase ไอโซไซม์ Os4bglu12 ของข้าว จากการตัดต่อ cDNA ของ Os4bglu12 เข้ากับ pET32/DEST vector เพื่อผลิตโปรตีนใน E. coli สายพันธุ์ OrigamiB (DE3) และ pPICZBNH8/DEST vector เพื่อผลิตโปรตีนใน P. pastoris พบว่าสามารถผลิตโปรตีนที่อยู่ในรูปที่ทำงานได้ปริมาณมาก ระบบนี้ได้นำมาใช้กับเอนไซม์ในกลุ่มไกลโคซิลไฮโดรเลส กลุ่มที่ 1 และ 35 ของข้าวไอโซไซม์ต่างๆ และสามารถผลิตโปรตีนที่อยู่ในสภาพที่ทำงานได้ได้สำเร็จเป็นจำนวนมาก และยังได้นำระบบนี้มาใช้ศึกษาผลของการกลายพันธุ์ของยีนของ-galactosidase (GalA) ของมนุษย์ ด้วยการผลิตโปรตีน-galactosidase จาก cDNA ปกติและกลายพันธุ์ที่ถูกตัดต่อเข้าไปใน pPICZBNH8/DEST vector ใน P. pastoris โดยสรุปโครงการนี้ทำให้เกิดการพัฒนาระบบการผลิตเอนไซม์ไกลโคซิเดสของยูคาริโอตในรูปแบบริคอมบิแนนท์โปรตีนเป็นอย่างมาก Abstract: Recombinant production of proteins is one of the most important steps in verification of gene functions, but it is often difficult to express active proteins from plants and other eukaryotes in recombinant systems and purify the proteins from them for characterization. In this project, we endeavored to create a system for recombinant expression and facile purification of isoflavone -glucosidases from Dalbergia species, express, purify and characterize those enzymes, and develop a rapid system for cloning and expressing plant enzymes in various expression systems. Initial attempts at expression of Dalbergia -glucosidases with C- and N-terminal polyhistidine tags as secreted proteins in Pichia pastoris suggested that proteolysis removed the tag on either end from the protein. To solve this problem, N- and C-terminal truncations were made and a 12-amino acid truncation from the N-terminus of D. cochinchinensis dalcochinase was found to allow expression of active protein that could be purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). The protein expressed and purified in this way had similar properties to dalcochinase purified from seeds. Attempts to express the D. nigrescens cDNA that had previously been cloned in E. coli and P. pastoris resulted in only inactive protein. Therefore, a second cDNA, dnbglu2, was cloned and was found to produce active -glucosidase/-fucosidase in this system, which, again could not be purified by IMAC with C- and N-terminal polyhistidine tags. When the protein was truncated at the N-terminus in the same way as dalcochinase, Dnbglu2 could be expressed and purified by IMAC. This protein also had similar activity to protein purified from D. nigrescens seeds, though slightly different, and had higher activity toward isoflavone 7-O--glycosides than D. cochinchinensis dalcochinase, but lower activity on the dalcochinase substrate, dalcochinin -glucoside. In order to make expression of plant glycosidases in our lab more efficient, we also developed a Gateway cloning and expression system by converting our most successful E. coli and P. pastoris expression vectors, pET32 and pPICZBNH8, respectively, to Gateway destination vectors and acquiring several other expression vectors. This system was tested on the rice -glucosidase gene Os4bglu12 and found to produce high amounts of active protein from the pET32/DEST in the OrigamiB (DE3) strain of E. coli and from the pPICZBNH8/DEST construct in P. pastoris. Since then, several other glycosyl hydrolase family 1 and 35 genes from rice have been successfully expressed. The system also provided a rapid way to assess the effect of a mutation in the GalA gene by expressing the human -galactosidase from the mutant and normal cDNA in P. pastoris media with the pPICZBNH8/DEST plasmid. Thus, this project allowed considerable advancement in eukaryotic glycosidase expression in recombinant systems.
Publications :
No
View Publications
Detail
Award/Honor :
Name
Sponsor
Get Date
IRD SEARCH
|
IRD LOGIN