Search :

Project Project Title : การแยกยีนพอริน (porin) จากเชื้อแบคทีเรีย Burkholderia pseudomallei และการศึกษาหน้าที่และโครงสร้างของพอรินที่แสดงออกในเชื้อ E. coli (Isolation of gene encoding an outer membrane protein, porin and expression in E.coli for functional characterisation)     downloaded 46 times Researcher Name : วิภา สุจินต์ (Wipa Suginta) Abstract : ในการศึกษาครั้งนี้ได้ทำการสกัดโปรตีนที่เยื่อเซลล์ด้านนอกของแบคทีเรีย Burkholderia pseudomallei และ B. thailandensis พบว่าโปรตีนทั้งสองตัวคือ BpsOmp38 และ BthOmp38 มีความสัมพันธ์กันในแง่อิมมูโนโลยี มีคุณสมบัติทนต่อ SDS ไวต่อความร้อน มีน้ำหนักโมเลกุลในรูปไตรเมอร์เป็น 110 kDa และน้ำหนักโมเลกุลในรูปโมโนเมอร์เป็น 38 kDa การทำ peptide mass fingerprinting โดยเทคนิค MALDI–TOF MS และ ESI/MS พบว่าโปรตีน Omp38 มีลำดับของกรดอะมิโนเหมือนกับพอริน OpcP1 ของเชื้อ B. cepacia มากที่สุด ได้นำข้อมูลโครงการหาลำดับนิวคลีโอไทด์จากจีโนมของ B. pseudomallei มาใช้ในการตรวจหายีนที่ถอดระหัสให้ BpsOmp38 และ BthOmp38 และทำการเพิ่มจำนวนยีนด้วยเทคนิค PCR การตรวจหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนทั้งสองพบว่ามีความเหมือนกัน 98% และมีลำดับกรดอะมิโนเหมือนกัน 99.7% การทำนาย transmembrane domain และโครงสร้างสามมิติพบว่าโปรตีนประกอบด้วยสายบีต้า 16 สาย มาประกอบเป็นโครงสร้าง β-barrel ต่อมาทำการโคลนยีน BpsOmp38 และยีน BthOmp38 เข้าไปในพลาสมิด pET23d(+) และทำการผลิตรีคอมบิแนนท์ Omp38 ในเซลล์เจ้าบ้าน Escherichia coli สายพันธุ์ Origami (DE3) พบว่าโปรตีนที่ผลิตโดย E. coli มีขนาด 38 kDa อยู่ในรูปที่ไม่ละลายน้ำในลักษณะ inclusion bodies จึงได้ทำบริสุทธิ์ inclusion bodies แล้วนำโปรตีนมาละลายใน 8M urea และทำการทดลอง refolding การวิเคราะห์ด้วย SDS-PAGE พบโปรตีนโมโนเมอร์ขนาด 38 kDa สามารถเกิดการ refold ได้ในสารละลายบัพเฟอร์ที่มี 10% (w/v) Zwittergent®3-14 รูปที่ refold มีการเคลื่อนตำแหน่งบน DSD-PAGE gel ไปอยู่ที่ 110 kDa การวิเคราะห์ด้วย CD spectroscopy พบว่าโปรตีน 110 kDa มีองค์ประกอบของ β-sheet เป็นหลักเหมือนกับโปรตีน Omp38 ดั้งเดิมที่สกัดจาก B. pseudomallei และ B. thailandensis การิเคราะห์ทางอิมมูโนโลยีโดยใช้ anti-BpsOmp38 polyclonal antibodies และการทำ peptide mass analysis ด้วย MALDI–TOF MS ยืนยันว่าโปรตีนที่ถูกผลิตโดย E. coli เป็น BpsOmp38 และ BthOmp38 การศึกษาหน้าที่พบว่า anti-BpsOmp38 antibodies มีผลต่อการยับยั้งอัตราแพร่ผ่านของน้ำตาลโมเลกุลเล็กเข้าสู่ช่อง Omp38 ที่ได้ทำการ reconstitute เข้าไปในลิโปโซม และอัตราการแพร่ผ่านของน้ำตาลโมเลกุลเล็กและยาปฏิชีวนะมีกราฟแปรผันโดยตรงกับน้ำหนักโมเลกุลของสารซึ่งแสดงให้เห็นว่าโปรตีน Omp38 มีคุณสมบัติเป็นช่องแพร่ผ่านพอริน ABSTRACT This study describes isolation of the outer membrane protein from Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. The isolated proteins, namely BpsOmp38 and BthOmp38, were found to be immunologically related, SDS-resistant, heat-sensitive trimers with the molecular weight of approx. 110 kDa. The monomeric proteins were found to be 38 kDa. Peptide mass fingerprinting by MALDI–TOF MS and ESI/MS showed that both Omp38 proteins had most sequence similarities to the OpcP1 porin from B. cepacia. Based on information from the B. pseudomallei genome-sequencing project, the genes encoding BpsOmp38 and BthOmp38 were subsequently identified and amplified by PCR technique. The nucleotide sequences of both genes were found to be 98% identical with the predicted amino acid sequences being 99.7% identical. Transmembrane domains and 3D-structure predictions suggested that this newly-isolated porin is a 16-stranded β-barrel. The genes encoded BpsOmp38 and BthOmp38 were further cloned into pET23d (+) expression vector, and then expressed in Escherichia coli host strain Origami (DE3). The 38 kDa proteins, expressed as insoluble inclusion bodies, were purified, solubilized in 8 M urea, and then subjected to refolding experiments. As analysed by SDS/PAGE, the 38 kDa band completely migrated to 110 kDa when the purified monomeric proteins were refolded in a buffer system containing 10% (w/v) Zwittergent®3-14. CD spectroscopy revealed that the 110 kDa proteins contained a predominant β-sheet structure, which corresponded completely to the structure of the native Omp38 isolated from B. pseudomallei and B. thailandensis. Immunoblot analysis using anti-BpsOmp38 polyclonal antibodies and peptide mass analysis by MALDI–TOF MS confirmed that the E. coli expressed proteins were BpsOmp38 and BthOmp38. Functional studies showed the considerable inhibitory effects of the anti-BpsOmp38 antibodies on the permeation of small sugars through the Omp38-reconstituted liposomes. A linear relation between relative permeability rates and the molecular weight of small sugars and antibiotics suggested strongly that the Omp38 functioned fully as a diffusion porin. Publications : No  View Publications  Detail Award/Honor :  Name  Sponsor  Get Date

IRD SEARCH | IRD LOGIN