Search :
Project
Project Title :
การผลิตลูกโคนมพันธุ์ดีเฉพาะเพศเมียโดยเทคโนโลยีโคลนนิ่ง (Production of only female exotic dairy cattle by cloning technology)
downloaded 43 times
Researcher Name :
รังสรรค์ พาลพ่าย (Rangsun Parnpai)
Abstract :
บทคัดย่อ การวิจัยนี้แบ่งเป็น 2 การทดลอง การทดลองที่ 1 มีวัตถุประสงค์เพื่อผลิตตัวอ่อนโคโคลนนิ่งโดยใช้เซลล์ใบหูจากโคนมพันธุ์ดีเพศเมีย แล้วนำตัวอ่อนระยะบลาสโตซีสเข้าทำการทดลอง เพื่อตรวจสอบระยะของ hatching มีผลต่อการอยู่รอดหลังจากแช่แข็งโดยวิธี vitrification และการเติม linoleic acid-albumin (LAA) ในน้ำยา IVC และ Ficoll ในน้ำยา vitrification จะเพิ่มการอยู่รอดหลังจากแช่แข็งหรือไม่ นำไข่ที่เชื่อมกับเซลล์ต้นแบบแล้วไปกระตุ้นด้วย ethanol และ cycloheximide-cytochalasin D (วัน 0) จากนั้นเลี้ยงตัวอ่อนในน้ำยา mSOFaa ที่มี 0.3% BSA หรือ 0.1% LAA + 0.2% BSA นำตัวอ่อนระยะ hatching blastocyst ที่เลี้ยงไว้ 7 วัน มาแบ่งออกเป็น 3 กลุ่มตามสัดส่วนของเส้นผ่าศูนย์กลางเซลล์ตัวอ่อนที่ออกมาจากชั้น zona pellucida และเส้นผ่าศูนย์กลางเซลล์ตัวอ่อนที่อยู่ภายในชั้น zona pellucida นำตัวอ่อนไปแช่แข็งโดยวิธี vitrification ในน้ำยา TCM199 + 20% FBS ที่มี 20% DMSO + 20% ethylene glycol + 0.5 M sucrose ที่เติมหรือไม่เติม 10% Ficoll โดยใช้ Cryotop เป็นภาชนะสำหรับแช่แข็ง ตรวจสอบการอยู่รอดหลังจากทำละลายด้วยการเลี้ยงในหลอดแก้วนาน 24 ชั่วโมง การเติม LAA ลงในน้ำยา IVC และน้ำยาสำหรับทำ vitrification ที่ไม่เติม Ficoll จะได้อัตราอยู่รอดของกลุ่ม early-hatching blastocyst (77%) ไม่แตกต่างจากกลุ่ม middle- และ late-hatching blastocyst (74 และ 80%, ตามลำดับ) การเติม Ficoll ในน้ำยา vitrification ไม่ช่วยให้มีอัตราการอยู่รอดของตัวอ่อนโคลนนิ่งระยะบลาสโตซีสเพิ่มขึ้น (54-68%) ตัวอ่อนระยะ early-hatching blastocyst ที่ผลิตในน้ำยาที่ไม่มี LAA จะรอดต่ำเมื่อเทียบกับกลุ่ม late-hatching blastocyst (56% vs 80%, p < 0.05) การตั้งท้องจนคลอดลูกโคโคลนนิ่งออกมาพบได้เฉพาะการฝากตัวอ่อนสดให้ตัวรับเท่านั้น การทดลองนี้สรุปได้ว่าตัวอ่อนโคโคลนนิ่งระยะ บลาสโตซีสไม่ว่าจะอยู่ในระยะ hatching ใดก็ตาม หากเลี้ยงในน้ำยาที่มี LAA จะมีอัตรารอดหลังจากแช่แข็งเท่าเทียมกัน และสามารถผลิตลูกโคนมพันธุ์ดีเพศเมียจากการทำโคลนนิ่งได้ การทดลองที่ 2 มีวัตถุประสงค์เพื่อผลิตตัวอ่อนโคโคลนนิ่งโดยใช้เซลล์ใบหูจากโคนมพันธุ์ดีเพศเมีย แล้วนำตัวอ่อนระยะบลาสโตซีสเข้าทำการทดลอง เพื่อเปรียบเทียบความเข้มข้นของ EG และ DMSO ในน้ำยา vitrification ต่ออัตราการอยู่รอดหลังแช่แข็งของตัวอ่อนโคโคลนนิ่งโดยวิธี micro-drop ใช้เซลล์ไฟโบรบลาสจากใบหูโคนมเพศเมียเป็นเซลล์ต้นแบบ เลี้ยงตัวอ่อนในน้ำยา mSOFaa medium + 0.3% BSA นาน 7 วัน นำตัวอ่อนระยะ middle- และ late-hatching blastocyst ไปแช่แข็งในน้ำยา VS33 (16.5% EG + 16.5% DMSO) หรือ VS35 (17.5% EG + 17.5% DMSO) โดยวิธี micro-drop การทำละลายตัวอ่อนทำโดยนำ micro-drop ไปไว้ใน 0.6 M sucrose ที่ 38 C นาน 5 นาที และล้างใน 0.4 0.2 และ 0 M sucrose ที่ 38 C นาน 5 นาทีในแต่ละครั้ง ตรวจสอบการอยู่รอด หลังจากทำละลายด้วยการเลี้ยงในหลอดแก้วนาน 24 ชั่วโมง และนำตัวอ่อนไปย้อมแบบ differential ด้วย 75 µg/mL propidium iodide + 100 µg/mL Hoechst 33258 ความอยู่รอดของตัวอ่อนระยะบลาสโตซีสหลังจากแช่แข็งในน้ำยา VS33 (86%) ไม่แตกต่างจากในน้ำยา VS35 (94%) จำนวนเซลล์ของตัวอ่อนที่แช่แข็งใน VS33 และ VS35 มี 13050 และ 12830 ตามลำดับ โคตัวรับมีการตั้งท้องที่ 60 วันหลังจากย้ายฝากตัวอ่อนสดและตัวอ่อนแช่แข็งในอัตรา 15.8 และ 11.8 % ตามลำดับ มีเพียงโคตัวรับที่ตั้งท้องจากตัวอ่อนสดได้คลอดลูกออกมา การทดลองนี้สรุปได้ว่าสามารถประสบความสำเร็จในการนำตัวอ่อนโคโคลนนิ่งระยะบลาสโตซีสนำไปทำ vitrification ในน้ำยา VS33 และ VS35 โดยวิธี micro-drop และสามารถผลิตลูกโคนมพันธุ์ดีเพศเมียจากการทำโคลนนิ่งได้ Abstract This experiment was divided into 2 experiments. In Experiment 1, the objective was to produce cloned embryos using ear fibroblasts of exotic female dairy cattle and then embryos at blastocysts stage were determined whether the hatching stage affected cryosurvival after vitrification, and whether addition of linoleic acid-albumin (LAA) to the IVC medium and Ficoll to the vitrification solution improves cryosurvival. Ear fibroblasts of female Holstein Friesian (HF) were used as donor cell. Fused couplets were activated with ethanol and cycloheximide-cytochalasin D (day 0), and were allowed to develop in mSOFaa medium presence of 0.3% BSA or 0.1% LAA + 0.2% BSA. Hatching blastocysts were harvested at day 7.0, and classified into one of three categories, according to the ratio of extruding embryonics diameter from zona to embryonic diameter inside the zona pellucida. The blastocysts were vitrified in 20% dimethylsulfoxide (DMSO) + 20% ethylene glycol (EG) + 0.5 M sucrose, with or without 10% Ficoll in TCM199 + 20% FBS, using Cryotop as a cryodevice. The post-thaw survival of the blastocysts was assessed by in vitro culture for 24 h. When the LAA-supplemented IVC medium and the Ficoll-free vitrification solution were used, cryosurvival of the early-hatching blastocysts (77%) was not different from those of middle- and late-hatching blastocysts (74 and 80%, respective). Inclusion of Ficoll in the vitrification solution did not improve the cryosurvival of cloned blastocysts (54 to 68%). Early hatching SCNT blastocysts produced in the absence of LAA were sensitive to vitrification procedure (cryosurvival 56%; p < 0.05 versus 80% in the late-hatching blastocysts). The full-term developmental potential of cloned blastocysts was proven only in the non-vitrified control group. In conclusion, bovine cloned blastocysts, regardless of their hatching stage, were relatively resistant to vitrification by the ultra-rapid cooling procedure when the blastocysts were produced in the presence of LAA and can be produced an exotic dairy calf from cloning technique. Experiment 2, the objective was to produce cloned embryos using ear fibroblasts of exotic female dairy cattle and then embryos at blastocysts stage were used to compared the effects of concentration of EG and DMSO in the vitrification solution on the survival rate of cloned bovine blastocysts vitrified by micro-drop technique. Ear fibroblasts of female HF were used as donor cell. The embryos were cultured in mSOFaa medium + 0.3% BSA for 7 days. Cloned blastocysts at middle- and late-hatching were vitrified in VS33 (16.5% EG + 16.5% DMSO) or VS35 (17.5% EG + 17.5% DMSO) using micro-drop technique. Embryos were warmed by directly placed micro-drop into 0.6 M sucrose at 38 C for 5 min and washed in 0.4 , 0.2 and 0 M sucrose for 5 min in each step at at 38 C. The post-thaw survival of the blastocysts was assessed by in vitro culture for 24 h and differential stained with 75 µg/mL propidium iodide + 100 µg/mL Hoechst 33258. The cryosurvival of blastocysts after cultured of VS33 (86%) was not significant different with VS35 (94%). Cell numbers of vitrified blastocysts were 13050 and 12830 in VS33 and VS35, respectively. The pregnancy rate at days 60 of fresh and vitrified embryos were 15.8 and 11.8 %, respectively. Only pregnant recipients from fresh embryos gave birth to live calves. In conclusion, bovine cloned blastocysts were successfully vitrified by using micro-drop technique in VS33 and VS35 and can be produced an exotic dairy calf from cloning technique.
Publications :
No
View Publications
Detail
Award/Honor :
Name
Sponsor
Get Date
IRD SEARCH
|
IRD LOGIN