Search :
Project
Project Title :
การค้นหาและการแสดงออกของกลุ่มยีน Glycosyl Hydrolases ในจีโนมของข้าวหอมมะลิและข้าวญี่ปุ่น (Search for new glycosyl hydrolases and theirs expression in KDML rice)
downloaded 41 times
Researcher Name :
มารินา เกตุทัต-คาร์นส์ (Mariena Ketudat-Cairns)
Abstract :
บทคัดย่อ การวิจัยนี้มีเป้าหมายเพื่อ (1) ศึกษาการแสดงออกของยีนกลุ่มไกลโคซิลไฮโดรเลสในอะเรย์ข้าวขนาด 45 K เพื่อเปรียบเทียบกับฐานข้อมูล ในอะเรย์ 45 K ของข้าวมีโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่มีความจำเพาะต่อไกลโคซิลไฮโดรเลสกลุ่มที่ 1 ทั้งสิ้น 26 กลุ่ม แต่มีเพียง 11 กลุ่มที่ตรงกับฐานข้อมูล เมื่อทำให้ข้าวอยู่ในสภาวะเครียด เทียบกับสภาวะปกติ มียีนที่มีการแสดงออกที่มีความแตกต่างกัน ลดลงตั้งแต่ 2 เท่าขึ้นไปเพียง 5 กลุ่ม (Os5bglu19 Os9bglu31 Os9bglu30, Os11bglu36 และ Os1bglu5) และมีเพียง 3 กลุ่ม (Os4bglu18 Os3bglu6 และ Os7bglu26) ที่มีการแสดงออกแบบเพิ่มขึ้นตั้งแต่ 2 เท่าขึ้นไป (2) ศึกษาหน้าที่ของยีนเบต้ากลูโคซิเดสจำนวน 5 ยีน คือ Os1bglu1 Os3bglu7 Os3bglu8 Os7bglu26 และ Os12bglu38 ด้วยเทคนิคอาร์เอ็นเอไอ ได้ทำการยับยั้งการแสดงออกของเบต้ากลูโค- ซิเดสทั้ง 5 ยีนพร้อมกัน โดยใช้ส่วนของ coding region ที่มีความเหมือนกันทั้ง 5 ยีน และยับยั้งการแสดงออกของแต่ละยีนโดยใช้ส่วนของ 3UTR ซึ่งมีความเฉพาะเจาะจงกับยีนเบต้ากลูโคซิเดสแต่ละตัว ยีนเป้าหมายถูกใส่เข้าไปในเวคเตอร์ pHELLSGATE8 และส่งเข้าไปในแคลลัสของข้าวโดยใช้แบคทีเรีย Agrobacterium เพื่อสร้างอาร์เอ็นเอสายคู่ในข้าว การชักนำการเกิดแคลลัสบนอาหารเพาะเลี้ยง N6D เป็นระยะเวลา 4 ถึง 6 สัปดาห์ ที่อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส มีประสิทธิภาพสูงที่สุดในการชักนำให้เกิดแคลลัสของข้าวขาวดอกมะลิ KDML105 และข้าวโคชิฮิคาริ ที่ 94.5 และ 93.4 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ สภาวะที่เหมาะสมสำหรับการถ่ายยีนเข้าสู่แคลลัสของข้าว คือ การบ่มแคลลัสร่วมกับแบคทีเรีย Agrobacterium ในอาหารเพาะเลี้ยง infection medium การคัดเลือกแคลลัสที่ได้รับการถ่ายยีนบนอาหารคัดเลือก N6D พบว่าสามารถถ่ายโอนยีนเข้าสู่แคลลัสของข้าวได้โดยพบแถบของดีเอ็นเอเป้าหมายของ nptII ในแคลลัสจากการทำการเพิ่มสายดีเอ็นเอด้วยเทคนิคพีซีอาร์ แคลลัสที่ได้รับการถ่ายโอนพลาสมิด ของชุดทดสอบควบคุม มีประสิทธิภาพในการถ่ายโอนมากที่สุด ที่ 19.7 เปอร์เซ็นต์ ส่วนแคลลัสที่ได้รับการถ่ายโอนพลาสมิดจากชุดทดสอบอื่นมีค่าอยู่ระหว่าง 15.3 ถึง 15.9 เปอร์เซ็นต์ การแสดงออกของ เอ็มอาร์เอ็นเอในแคลลัสที่ผ่านการยับยั้งการแสดงออกของแต่ละยีน พบว่าไม่มีการแสดงออกของเอ็ม-อาร์เอ็นเอของยีนนั้นๆ ในการยับยั้งการแสดงออกของยีน Os1bglu1 Os3bglu8 และ Os7bglu26 แต่ในการยับยั้งการแสดงออกของยีน Os3bglu7 ยังพบการแสดงออกของเอ็มอาร์เอ็นเอในระดับที่ต่างกันในแคลลัส ส่วนยีน Os12bglu38 นั้นปกติจะไม่พบการแสดงออกของเอ็มอาร์เอ็นเอในแคลลัส การตรวจสอบกระบวนการอาร์เอ็นเอไอที่เกิดขึ้นในแคลลัสโดยใช้ Northern blot เพื่อตรวจหาเอสไอ- อาร์เอ็นเอพบว่าแคลลัสของแต่ละชุดทดสอบที่ยับยั้งการแสดงออกของยีน Os1bglu1 Os3bglu8 Os7bglu26 และ Os3bglu7 สามารถตรวจพบเอสไออาร์เอ็นเอได้ในระดับที่แตกต่างกัน แต่ไม่พบในแคลลัสที่ผ่านการถ่ายโอนพลาสมิดของชุดทดสอบควบคุม การชักนำให้เกิดการพัฒนาไปเป็นต้นข้าวของแคลลัสบนอาหารเพาะเลี้ยง พบว่าเฉพาะแคลลัสที่ได้รับการถ่ายโอนพลาสมิดของชุดทดสอบควบคุมและแคลลัสของชุดทดสอบที่ยับยั้งการแสดงออกของยีน Os12bglu38 สามารถชักนำให้แคลลัสพัฒนาไปเป็นต้นข้าวได้ 5.5 และ 3.1 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ และพบแถบของดีเอ็นเอเป้าหมายของ nptII ในตัวอย่างต้นข้าวทุกตัวอย่างจากทั้ง 2 ชุดทดสอบ แต่ไม่พบความแตกต่างของลักษณะต้นข้าวที่ปรากฎของต้นข้าวที่ได้รับถ่ายโอนพลาสมิดของชุดทดสอบควบคุม และชุดทดสอบที่ยับยั้งการแสดงออกของยีน Os12bglu38 เลย Abstract This research attempted to study (1) the expression of Glycosyl Hydrolase in 45 K array to compare with databases. The study found 26 groups of Glycosyl Hydrolase family I in the 45 K array with only 11 groups similar to the NCBI databases. The expression of these genes under stress conditions indicated that only 5 groups (Os5bglu19, Os9bglu31, Os9bglu30, Os11bglu36 and Os1bglu5) decreased 2 folds or more and 3 groups (Os4bglu18, Os3bglu6 and Os7bglu26) increased 2 folds or more when compare to the normal condition. (2) The function of 5 β-glucosidase genes (Os1bglu1, Os3bglu7, Os3bglu8, Os7bglu26 and Os12bglu38) was studied by RNAi technique. The suppression of 5 β-glucosidase genes were knocked down with one construct containing a highly conserved coding region that matched all 5 genes. And individual β-glucosidase genes were knocked down with 3UTR sequences of each gene. The target genes fragment were cloned into the pHELLSGATE8 vector and then transferred into rice calli via Agrobacterium to produce dsRNA in rice. High percentages of effective callus induction of 94.5% and 93.4% were obtained when seeds of rice cv. KDML105 and Koshihikari were cultured on N6D medium for 4-6 weeks at 28oC, respectively. The suitable conditions for rice transformation with Agrobacterium were to grow the calli on N6D selection medium and then checked for the presence of the nptII gene to confirm the integration of T-DNA fragment in the calli. High transformation efficiency of 19.7% was obtained from the calli transformed with control plasmid while the individual gene knock down constructs had transformation efficiencies of about 15.3-15.9%. Expression of Os1bglu1, Os3bglu8 and Os7bglu26 mRNA was not found in calli transformed with their respective knock down constructs. However, Os3bglu7 still shows mRNA expression at different levels after transformation with its knock down construct. The mRNA expression of Os12bglu38 was not found in normal nontransformed callus. Northern blot analysis was performed to check the presence of siRNA to confirm the RNAi mechanism in calli. The results indicated that different siRNA levels were found in the calli with the Os1bglu1, Os3bglu8, Os7bglu26 and Os3bglu7 constructs but no siRNA could be detected in the control transformed calli. The plantlet regeneration efficiencies at 5.5% and 3.1% were obtained from the calli transformed with the control and Os12bglu38 contructs, respectively. All transformed plantlets contained the nptII gene from the T-DNA integration. Plantlets transformed with the control and Os12bglu38 contructs did not show any differences in the phenotype.
Publications :
No
View Publications
Detail
Award/Honor :
Name
Sponsor
Get Date
IRD SEARCH
|
IRD LOGIN