Search :

Project Project Title : การศึกษาการแสดงออกและการตรวจสอบโปรตีน SFR2 จากข้าวใน Escherichia coli และ Pichia pastoris (The Expression and Detection of Rice SFR2 in Escherichia coli and Pichia pastoris)     downloaded 34 times Researcher Name : มารินา เกตุทัต-คาร์นส์ (Mariena Ketudat-Cairns) Abstract : บทคัดย่อ งานวิจัยนี้เป็นการศึกษาการแสดงออกของโปรตีน SFR2 ของข้าวใน E. coli และ P. pastoris ส่วนทางด้านปลายเอ็นและปลายซีของโปรตีน SFR2 ถูกสร้างใน E. coli ด้วยระบบของ pET32a ผลการทดลองพบว่ามีเพียงกรดอะมิโน 260 ตัวทางด้านปลายซีและกรดอะมิโน 174 ตัวทางด้านปลายเอ็นเท่านั้นสามารถแสดงออกใน E. coli ได้ส่วนของ PEST sequence ที่พบในโปรตีน SFR2 ซึ่งเป็นลำดับของกรดอะมิโนที่มีการเหนี่ยวนำให้เกิดการย่อยสลายของโปรตีนโดยโปรติเอสถูกทำให้เปลี่ยนแปลงโดยเปลี่ยนกรดอะมิโนกลูตามิกเป็นกลูตามีนโดยวิธีพีซีอาร์มิวตาเจนเนซิส อย่างไรก็ตามเมื่อทำให้มีการแสดงออกของโปรตีนพบว่า SFR2 ที่มีการมิวเทตไม่สามารถสร้างโปรตีนได้ ดังนั้นจึงเปลี่ยนระบบจาก pET32a ไปเป็น pCold I และทำให้มีการแสดงออกใน E. coli เช่นเดิม ผลการทดลองพบว่าโปรตีน SFR2 ไม่สามารถแสดงออกได้โดยใช้ pCold I เช่นกัน เนื่องจากข้อจำกัดของการย้อมสี Coomassie blue ในการตรวจสอบโปรตีนบน SDS-PAGE จึงได้ทำการตรวจสอบโปรตีนโดยเทคนิคเวสเทิร์นบลอทเพื่อตรวจสอบหาโปรตีน SFR2 โดยการใช้โปรตีนส่วนปลายซีของ SFR2 เป็นแอนติเจนเพื่อสร้างแอนติเซรัม ผลการทดลองพบการแสดงออกของโปรตีน SFR2 แต่มีในปริมาณเพียงเล็กน้อย ดังนั้นระดับอาร์เอ็นเอของ SFR2 จึงถูกตรวจสอบโดยใช้เทคนิคนอร์ทเทิร์นบลอทพบว่า ระดับอาร์เอ็นเอของส่วนทางด้านปลาย 5’ (ปลายเอ็นของโปรตีน) แสดงความสัมพันธ์กับผลการทดลองที่แสดงบนแผ่นเมมเบรนคือระดับอาร์เอ็นเอน้อยจึงส่งผลให้มีการแสดงออกของโปรตีนที่น้อยด้วย อย่างไรก็ตามผลการทดลองของระดับอาร์เอ็นเอทางปลาย 3’ (ปลายซีของโปรตีน) ไม่ได้แสดงออกในทิศทางเดียวกัน โปรตีน SFR2 ถูกนำมาผลิตใน P. pastoris อย่างไรก็ตามผลการทดลองใน SDS-PAGE ไม่ได้บ่งบอกอย่างชัดเจนว่ามีการแสดงออกของ SFR2 หรือไม่ ในส่วนของการติดตามตำแหน่งของโปรตีนพบว่า โปรตีน SFR2 มีการเคลื่อนที่ไปที่คลอโร พลาสของเซลล์หัวหอมและสาหร่ายหางกระรอก   Abstract The rice sensitive to freezing2 (SFR2) gene was cloned and expressed in E. coli and P. pastoris. The SFR2 proteins with N-terminal and C-terminal deletions were expressed in E. coli with the pET32a system. Results indicated that only 260 amino acids of the C-terminal and 174 amino acids of the N-terminal regions could be produced in E. coli. A PEST sequence, a region known to target its protein to proteolysis was found in the rice SFR2 protein. The PEST sequence in SFR2 was mutated by changing glutamic acids to glutamine. Then the mutated gene was expressed in E. coli. However, Coomassie blue stained SDS-PAGE could not detect any expressed SFR2 protein. The expression vector was changed to pCold I and again the SFR2 gene deletion were expressed in E. coli. The results still showed no detectable protein on SDS-PAGE. Because of the limitation of Coomassie blue staining, western blot analysis was done. The C-terminal region of SFR2 protein (28_SFR2) was used as antigen to produced rabbit antisera. With this antisera, it was shown that the SFR2 protein could be expressed in E. coli, but only in very small amounts which were not detected by Coomassie blue stained SDS-PAGE. To determine the reasons, the RNA levels were investigated. The amount of RNA of the 5’s region, encoding the N-terminal region, correlated with the western blot results that the lower RNA levels showed low protein levels. In contrast, the RNA encoding the C-terminal region did not show the same correlation. P. pastoris was also used as expression host but no detectable protein can be found on SDS-PAGE even with the SFR2 with codons optimized for P. pastoris expression. For protein localization using GFP and GUS protein as reporter protein indicated that SFR2 protein localized to chloroplast of hydrilla and onion cells. Publications : No  View Publications  Detail Award/Honor :  Name  Sponsor  Get Date

IRD SEARCH | IRD LOGIN