Search :

Project Project Title : การโคลนและผลิตเอนไซม์ Enterokinase(Enterokinase Cloning and production)     downloaded 52 times Researcher Name : มารินา เกตุทัต-คาร์นส์ (Mariena Ketudat-Cairns) Abstract : บทคัดย่อ เอนเทอโรไคเนสเป็นเอ็นไซม์จำพวกซีรีนโปรติเอสซึ่งจะตัดพันธะเปปไทด์ทางด้านปลายคาร์บอกซี่ของตำแหน่งตัดจำเพาะ (Asp4Lys) และเนื่องจากเอ็นไซม์เอนเทอโรไคเนสสามารถทำงานได้ในสภาวะที่หลากหลาย จึงทำให้เอนเทอโรไคเนสมีความเหมาะสมอย่างยิ่งในการนำมาใช้ตัดฟิวชันโปรตีนที่ตำแหน่งจำเพาะ ในงานวิจัยนี้ ผู้วิจัยได้ทำการโคลนและผลิตเอ็นไซม์เอนเทอโรไคเนสสายสั้นในระบบรีคอมบิแนนท์ (rEKL) จากลำไส้วัว จากการเพิ่มปริมาณดีเอนเอของยีนเอนเทอโรไคเนสสายสั้น (EKL) จากลำไส้วัวและควายในประเทศไทยโดยเทคนิค RT-PCR และ nested PCR พบว่า ผลิตภัณฑ์ดีเอนเอที่เพิ่มจำนวนได้มีขนาด 708 คู่เบส และทำนายลำดับกรดอะมิโนได้ 235 กรดอะมิโน ซึ่งลำดับกรดอะมิโนของโปรตีน EKL จากควายที่ได้จากงานวิจัยนี้มีความใกล้เคียงกับลำดับกรดอะมิโนของโปรตีน EKL จากวัวที่มีการรายงานจากงานวิจัยที่ผ่านมา และพบว่ากรดอะมิโนของยีน EKL จากวัวในประเทศไทยมีความแตกต่างเพียง 1 ตำแหน่งเท่านั้น ในขั้นตอนการชักนำยีน EKL จากวัวที่ได้นี้ให้เกิดการแสดงออกและทำเอ็นไซม์ให้บริสุทธิ์พบว่า rEKL ที่ผลิตโดยใช้ Pichia pastoris สายพันธุ์ Y11430 สามารถทำงานได้และสามารถตรวจพบกิจกรรมของเอ็นไซม์นี้ในอาหารที่ได้จากการเลี้ยง Pichia ในถังหมักในช่วงที่มีการชักนำให้เกิดการแสดงออกของเอ็นไซม์นี้ในระบบรีคอมบิแนนท์ด้วยเมธานอล ในระหว่างกระบวนการเหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกนั้นพบว่า การผลิตเอ็นไซม์ที่อุณหภูมิต่ำนั้นไม่สามารถปรับปรุงคุณภาพของเอ็นไซม์ที่ผลิตให้มีคุณภาพที่ดีขึ้น แต่สามารถเพิ่มผลผลิตของโปรตีนในระบบรีคอมบิแนนท์ได้ หลังจากสิ้นสุดกระบวนการทำเอ็นไซม์ให้บริสุทธิ์โดยเทคนิคการแลกเปลี่ยนประจุพบว่า ความเข้มข้นของ rEKL บริสุทธิที่ได้คือ 433 มิลลิกรัมต่อลิตรซึ่งได้จากการเหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกของ rEKL ที่อุณหภูมิต่ำ สำหรับความสามารถในการตัดฟิวชันโปรตีนที่มีตำแหน่งตัดของเอ็นไซม์ EK (Asp4Lys) พบว่า rEKL ที่บริสุทธิ์ซึ่งได้จากงานวิจัยนี้สามารถตัดสับเสรตที่เป็นฟิวชันโปรตีนของ rice BGlu1-thioredoxin ได้เมื่อบ่มที่ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 ชั่วโมง ซึ่งผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการตัดฟิวชันโปรตีนด้วย rEKL ที่ได้จากงานวิจัยนี้และ rEKL ที่ผลิตขายตามท้องตลาดนั้นมีรูปแบบของแถบโปรตีนที่ปรากฏบนเจล SDS-PAGE คล้ายคลึงกัน Abstract Enterokinase is a serine protease which catalyzes the hydrolysis of peptide bonds at the C-terminal end of the specific cleavage site (Asp)4Lys. It retains full activity in various reaction conditions, which makes it suitable for site-specific cleavage of fusion proteins. In this research, cloning and production of recombinant bovine enterokinase light chain (rEKL) were achieved. Thai bovine and buffalo EKL gene amplification by RT-PCR and nested PCR produced 708 bp PCR products, which encoded 235 predicted amino acids. Only one amino acid mutation was found in the Thai bovine EKL. The obtained protein sequence of Thai buffalo EKL in this research was closely related to that previously reported for bovine EKL. In the step of bovine rEKL expression and purification, rEKL active could be obtained from expression system using Pichia pastoris Y11430. The enzymatic activity was detected in the recombinant Pichia fermentor culture supernatant during the methanol production phase. Low temperature production did not improve the quality of rEKL, but did increase the yield of recombinant protein. After ion exchange purification, 433 mg/L of purified rEKL was obtained from fermentation under the low induction temperature condition. The ability of rEKL to cleave a specific (Asp)4Lys site of rice BGlu1-thioredoxin fusion proteins showed that fusion protein was cleaved by the purified rEKL from this research in 4 h at 30oC. The products of cleavage of the fusion protein with commercial rEKL and rEKL from this research showed similar patterns on SDS-PAGE. Publications : No  View Publications  Detail Award/Honor :  Name  Sponsor  Get Date

IRD SEARCH | IRD LOGIN